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标题: 幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究 [打印本页]
作者: 薛家宾    时间: 2008-1-31 16:24
标题: 幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究
幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究
/ h7 B: b% T. z( \6 J4 q杨龙圣，薛家宾，徐为中，胡元亮
+ }5 o+ f( X( w2 T; f; s- {& D+ a, E
& O( X# V6 Y3 q7 q9 H; D/ i* ?4 d兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（RHD virus，RHDV）引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病,常呈爆发性流行，发病率和死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒（RHDV）对青年、成年兔致病高，对二月龄以下幼兔一般不感染发病[1～3]。近年来的幼兔发生兔出血症逐渐增多[4～6]，一些学者认为初免日龄在45日龄左右为宜，最好是用兔瘟单苗加倍免疫注射，60日龄左右再加强免疫一次[7]。而一部分养殖单位在仔兔断奶前后（30-35日龄）就免疫兔瘟苗，仅用单倍剂量，不再加强免疫，有时会发生免疫注射兔瘟苗后仍然发生兔瘟病[8][9]。为探明免疫注射后仍然发病的根源，进行了本试验研究。旨在通过免疫日龄及剂量与抗体产生之间的关系研究，明确幼兔兔瘟苗免疫的客观规律。
! d/ ~* [" y, G1 材料与方法
& x# a. q3 c, O' [- n8 p1.1 材料( G- x  [  t7 t
新西兰兔，35、40、45日龄。兔病毒性出血症组织灭活疫苗（批号20041201），阳性血清，阴性血清，兔出血症病毒（RHDV，皖阜株）均由江苏省农业科学院兽医研究所提供；人“O”型红细胞，由南京军区总医院提供。2 E0 a' d- K0 G; t! G6 a
TGL-16G台式高速离心机，由上海医用分析仪器厂生产；WMK-2型37℃恒温箱，南京试验仪器厂；100µl移液枪，eppendorf公司生产；50孔U型血凝板。/ L1 ?& e. x% D$ F
1.2 动物分组与血样处理; V0 t% E% P/ V5 \
分别取35、40、45日龄幼兔各30只，每个日龄组分不免疫、免疫剂量1、免疫剂量2、免疫剂量3、免疫剂量4五个处理组，共15组，每个剂量组6只幼兔，颈部皮下注射兔瘟疫苗。注射疫苗后，每周1次耳静脉或心脏采血。血液置37℃温箱内1小时，10000rpm/min离心10min，吸取上清。血清置56℃水浴锅内30min后，用于测定抗体效价。
+ m7 C8 f, f2 F* N1.3 兔瘟抗体效价的测定
' H, R7 }' e- L/ S0 w8 j: M6 O微量血凝抑制试验（HI）方法检测兔瘟抗体[10]。取50µl待检血清用等量生理盐水进行倍比稀释6个梯度，分别在每孔加入等量的4单位血凝病毒，37℃感作30min，加入等量的1％人“O”型红细胞，4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清作为对照。结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件从剂量和日龄两个角度作统计分析。/ u5 ?: Q% z7 v7 I! o0 w0 x9 E
2 结果与分析
0 q4 b3 ^. F7 E3 e2 S6 n2.1 35日龄不同剂量组的抗体效价/ p/ o, ]8 {% b, G3 |
35日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4后，其抗体产生速度较剂量1组快，剂量2、3、4组抗体效价一直显著高于剂量1组，剂量2、3、4组抗体效价峰值5.83显著高于剂量1组峰值3.25，有效抗体维持时间(>7周)大于剂量1组的2周。35日龄组幼兔剂量2、3、4组之间抗体产生速度、峰值、维持时间均无显著差异（表1）- t3 f" }) B, |+ N  ?
表1  35日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
. [# {) ~; B5 ?& a+ k( ~' M* sTable 1. Diversification of the antibody of the 35 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine" |  n2 x# R/ o3 `
免疫9 F$ O4 X' s' q1 v4 P9 j
剂量        免疫前        免疫后' Q4 p4 d6 w8 }" @# q  R, H
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周  A2 Q* K7 D+ l; ]4 D9 j- z
0        2.50±0.41        1.25±0.95b        1.00±0.82c        0.75±0.96c        0.25±0.50d        0.25±0.50d        0.00±0.00d        0.00±0.00c7 _4 y1 h; c9 S1 u
1        2.50±0.41        3.25±0.50a        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00c        1.00±0.00c        0.75±0.50c        0.00±0.00c
& t8 n: a' a5 `8 M4 W$ {# V7 M2        2.00±1.00        4.00±0.00a        4.66±0.58a        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71b        4.50±0.73ab        4.50±0.53a
+ r' X7 f4 ~: c3        2.00±1.00        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00b        5.25±0.35ab        4.25±0.23b        4.00±0.34b# ]$ @) h+ g8 G7 E
4        2.33±0.58        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.83±0.29a        5.50±0.00a        4.75±0.56a        4.33±0.26ab! G; h% z: j) ?, Q- `. T
注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。2 k8 g) Z2 D7 t. \/ j
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same as follows.
& @8 u0 d/ }) D" J& {4 H
2 v/ t. S+ Q4 {* e9 ?" A2.2 40日龄不同剂量组的抗体效价
* V3 W3 b4 n3 Z3 t9 }40日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，剂量2、3、4组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，剂量2、3、4组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表2）) p( Z% n' o; B9 s; @
表2  40日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
5 L) N4 I3 }7 Q' hTable 2 .Diversification of the antibody of the 40 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine- G- w: B4 s# @8 ~
免疫剂量        免疫前        免疫后/ ~# s$ A: K" n8 N6 R' C. U
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
, w, r6 K7 n# G# N( S0        1.25±0.58        1.00±0.82b        0.75±0.96b        0.25±0.50b        0.20±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
0 \/ p2 e3 n7 b1        1.25±0.96        3.00±0.82a        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96b        3.00±0.82b        2.13±0.50b        1.83±0.58b
3 k" e1 a- c1 x2        1.33±0.58        4.33±1.15a        5.83±0.29a        5.17±0.29a        5.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        4.50±0.00a- @9 I9 h% n: n) r
3        1.27±0.58        4.00±1.00a        5.50±0.50a        5.17±0.29a        5.00±1.00a        5.00±0.58a        5.00±0.29a        4.50±0.00a
7 j" L6 a3 a3 B5 Y; I4        1.33±0.58        4.33±0.58a        5.83±0.29a        5.17±0.35a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        5.00±0.35a        4.50±0.29a) [5 o; U* h. ~: Z2 ]' s! @

- Q' V+ z8 Y8 _! W/ u8 A7 b2.3 45日龄不同剂量组的抗体效价
4 e+ L7 P: t1 q! W45日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，免疫后第5周，2～4单位剂量剂量组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，2～4单位剂量剂量组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表3）。
, e8 n4 t. V- d6 F2 i% a+ X表3  45日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化; |$ r" G+ P9 W* I/ S
Table 3 .Diversification of the antibody of the 45 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine( |) e( X7 _6 {7 {- l# _
免疫剂量        免疫前        免疫后1 k; J5 H9 B) K1 u/ T) d* u" J+ N
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周: b1 H7 q/ o8 k
0        1.00±0.57ab        0.80±0.96b        0.35±0.50b        0.25±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
9 r' J4 e+ P+ R" N0 n0 b% a/ f1        2.00±0.82a        3.25±1.26a        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96b        3.25±1.26b        2.38±1.79b        2.00±1.41b
: |. g, \8 E2 d. ]9 L: p9 ?, L2        1.00±0.00ab        4.00±1.00a        5.17±0.58a        4.83±0.29b        5.16±0.76ab        5.50±0.45a        5.50±0.00a        4.75±0.59a
4 w6 i1 g/ z4 U' t+ I3        1.00±1.00ab        4.47±0.50a        5.25±1.06a        5.50±0.00a        5.75±0.35a        5.25±1.06a        5.00±0.50a        4.50±0.56a6 G8 k/ W/ l6 j1 j3 Z/ q
4        0.33±0.58b        4.33±0.58a        5.50±0.00a        5.50±0.00a        5.25±0.35ab        5.25±0.35a        5.00±0.50a        4.50±0.36a  i- I# @, Q; q: H
/ A9 Y9 a( M+ B  |
2.4 35、40、45日龄组免疫剂量1疫苗后的抗体效价
4 J: s8 h4 x) N/ _, Q/ F' I. V注射剂量1疫苗时，免疫后第1周，各日龄组之间抗体效价没有显著差异，免疫后2～3周，3个日龄组抗体效价均上升至峰值，40、45日龄组抗体效价均显著高于35日龄组，40、45日龄组之间抗体效价没有显著差异，35日龄组有效抗体维持时间为2周，40～45日龄有效抗体维持时间为4周（表4）8 u. ~6 ~- R5 u6 X
表4  不同日龄幼兔免疫剂量1后抗体变化比较# t& ~( j/ B. k
Table 4 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 1-unit dose of vaccine ( O/ b( ]& p, l$ \. Z1 m
免疫日龄        免疫前        免疫后2 W6 Q  j5 G9 z7 n* e
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
& `# f' h/ [+ V2 X( W35日龄        2.50±0.41a        3.25±0.50        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00b        1.00±0.00b        0.75±0.50b        0.00±0.00b
  x6 c% o. G7 }( g6 z2 `40日龄        1.25±0.96b        3.00±0.82        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96 ab        3.00±0.82a        2.13±0.50a        1.83±0.58a
% `% J) K+ F3 [7 d45日龄        2.00±0.82ab        3.25±1.26        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96a        3.25±1.26a        2.38±1.79a        2.00±1.41a5 ^) P/ ^; o* p) F$ y* u
注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
1 Z5 G8 n; E/ o: S4 p* G, E% b3 _Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.2 S+ A( t2 t, B/ t; q9 p/ r: w
& g$ v; h! x) M& R
2.5 35、40、45日龄组免疫剂量2疫苗后的抗体效价
9 U) r8 X8 J* \7 n8 w注射剂量2兔出血症疫苗之后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表5）
8 o9 N& w3 u' }. ^# ^! Z0 _表5  不同日龄幼兔免疫剂量2后抗体变化比较
0 s' K" `+ V& y. {Table 5 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 2-unit dose of vaccine & X! D: w# _) e
免疫日龄        免疫前        免疫后  p% r* B+ x& S  s' N% B' x5 O3 d) M
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周- _- ]4 |' g+ W- J+ k# |
35日龄        2.00±1.00        4.00±0.00        4.66±0.58b        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71        4.50±0.73b        4.50±0.53
) k9 o- I; }8 n" D$ \" G/ M40日龄        1.33±0.58        4.33±1.15        5.83±0.29a        5.17±0.29ab        5.33±0.58ab        5.33±0.00        5.00±0.00ab        4.50±0.00. `$ X+ Y) P: }1 b5 q0 Q5 b$ X
45日龄        1.00±0.00        4.00±1.00        5.17±0.58ab        4.83±0.29b        5.16±0.76b        5.50±0.00        5.50±0.00a        4.75±0.59
# _3 L' ?* Q# d4 {! o* t. P/ E, D4 L
! i  E6 c. Q  w; [, p5 v2.6 35、40、45日龄组免疫剂量3、4疫苗后的抗体效价
- u8 t1 U- b! h2 Y! Z& Y0 S用剂量3、4注射兔出血症疫苗后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表6、7）。
! j. i/ x5 O# u  o9 n, U3 y& c表6  不同日龄幼兔免疫剂量3后抗体变化比较
0 M0 ?0 T3 \2 ]+ P1 y* ^5 Z% VTable 6 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 3-unit dose of vaccine
2 }+ g( p/ ?* P8 `免疫
. e8 |. V' k7 ?4 O日龄        免疫前        免疫后
8 i6 f( K' y& m5 u' U' `* M3 C                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周  t. t  c  M" T6 s: W
35日龄        2.00±1.00        4.00±1.00        4.33±0.58        5.33±0.58        5.00±0.00        5.25±0.35        4.25±0.23b        4.00±0.34) ?# I: `) ?# J  x( k& r+ h
40日龄        0.67±0.58        4.00±1.00        5.50±0.50        5.17±0.29        5.00±1.00        5.00±0.00        5.00±0.29a        4.50±0.00
! \1 h7 f1 x- v5 Y45日龄        1.00±1.00        4.47±0.50        5.25±1.06        5.50±0.00        5.75±0.35        5.25±1.06        5.00±0.50a        4.50±0.56
0 S: `) `* @" U- X
0 G8 {& Y6 T* S表7  不同日龄幼兔免疫4单位剂量后抗体变化比较
: _& `& K- E( n  Q- E# KTable 7 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 4-unit dose of vaccine
9 w3 r/ S. J( W3 n$ X9 \免疫& E2 B+ M% u/ e' n' U5 u
日龄        免疫前        免疫后, O4 ?' N9 g$ {" T8 I
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
# w: x' J$ e2 f. k% _3 [7 b4 ~* O35日龄        2.33±0.58a        4.00±1.00        4.33±0.58b        5.33±0.58        5.83±0.29        5.50±0.00        4.75±0.56        4.33±0.26
+ r( ~8 m) U% T3 g# `* S40日龄        1.33±0.58ab        4.33±0.58        5.83±0.29a        5.17±0.35        5.33±0.58        5.00±0.00        5.00±0.35        4.50±0.29
5 [) j* q9 }3 G) U, D45日龄        0.33±0.58b        4.33±0.58        5.50±0.29a        5.50±0.00        5.25±0.35        5.25±0.35        5.00±0.50        4.50±0.366 G$ T0 {5 V" F1 [
/ M6 v$ C9 G. w1 {1 t& [6 g
3 小结与讨论5 x2 L/ A' i, r5 K
3.1 相同日龄免疫剂量与抗体产生之间的关系" B: c5 v* Q% ]6 S
35日龄的剂量2、3、4组的抗体峰值、有效抗体维持时间、抗体产生速度均显著大于剂量1组，但是剂量2、3、4组之间的抗体峰值、有效抗体维持时间没有显著差异，抗体产生速度与40、45日龄的剂量2、3、4组均为1周，抗体峰值的产生较40、45日龄的剂量2、3、4组仅慢1周。40日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。45日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。
# w& D, H  s! \3.2 同一剂量的不同免疫日龄与抗体产生之间的关系1 [, x5 t, _% f+ u/ _* a
免疫结果表明，不同日龄在免疫剂量1时，免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关。35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值均显著小于其它日龄组。免疫剂量2～4时，35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值与其它日龄组之间无显著差异。说明加大剂量之后，可以解决当前存在的免疫程序问题。
5 X: m2 g7 F+ Y& I8 B% V( Q        目前，国内幼兔免疫机理方面的研究开展很少，人们对其免疫规律以及机理还不是十分清楚。本研究结果证明了兔出血症免疫程序中确实存在一些问题，同时提出了一些建议以供参考，并为进一步的深层次研究提供了实践依据。: r: y8 n1 `7 [

0 ?) ^6 N5 ~- ]3 b$ F7 G- B[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-1-31 16:25 编辑 ]
作者: 王高    时间: 2008-1-31 16:52
好
作者: qiuhuangang    时间: 2008-2-2 00:50
谢谢教授........
作者: 王高    时间: 2008-2-2 10:48
从薛老师得到的提示应该是35日龄的小日龄可以注射，加倍注射效果好。但是我们实际当中的商品肉兔都是28日龄断奶，到35日龄也隔了好几天了。我想问实际当中刚刚断奶时可否注射兔瘟疫苗？请薛老师看看行不行。
作者: 1985su    时间: 2008-2-2 14:04
兔瘟/波氏。魏氏苗的效果确实。大肠杆菌根本就多余，巴氏还有一定的用途
作者: 薛家宾    时间: 2008-2-3 08:45
标题: 回复 4楼 的帖子
建议再看一下另一篇文章-免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响.
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; W, t# u7 Z, u' l& W[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-2-3 08:46 编辑 ]
作者: 张连春    时间: 2008-2-3 20:45
:vic tory:



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