幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究

薛家宾

幼兔兔出血症疫苗体液免疫反应研究
7 K9 W0 |1 [/ t; {杨龙圣，薛家宾，徐为中，胡元亮

. |% `1 H/ Z8 U8 {6 R+ |. \" \8 [- P兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（RHD virus，RHDV）引起的家兔的一种急性、高度接触性传染病,常呈爆发性流行，发病率和死亡率极高，给养兔业造成极大的经济损失[1]。兔出血症病毒（RHDV）对青年、成年兔致病高，对二月龄以下幼兔一般不感染发病[1～3]。近年来的幼兔发生兔出血症逐渐增多[4～6]，一些学者认为初免日龄在45日龄左右为宜，最好是用兔瘟单苗加倍免疫注射，60日龄左右再加强免疫一次[7]。而一部分养殖单位在仔兔断奶前后（30-35日龄）就免疫兔瘟苗，仅用单倍剂量，不再加强免疫，有时会发生免疫注射兔瘟苗后仍然发生兔瘟病[8][9]。为探明免疫注射后仍然发病的根源，进行了本试验研究。旨在通过免疫日龄及剂量与抗体产生之间的关系研究，明确幼兔兔瘟苗免疫的客观规律。
1 材料与方法
' a* Q1 a8 ~) F& g2 K1.1 材料
, |! @# k7 B3 W/ N5 M新西兰兔，35、40、45日龄。兔病毒性出血症组织灭活疫苗（批号20041201），阳性血清，阴性血清，兔出血症病毒（RHDV，皖阜株）均由江苏省农业科学院兽医研究所提供；人“O”型红细胞，由南京军区总医院提供。
% g. Y, F5 V# P* i$ xTGL-16G台式高速离心机，由上海医用分析仪器厂生产；WMK-2型37℃恒温箱，南京试验仪器厂；100µl移液枪，eppendorf公司生产；50孔U型血凝板。
# X  D' C1 n1 x# L, R6 y. w1.2 动物分组与血样处理
分别取35、40、45日龄幼兔各30只，每个日龄组分不免疫、免疫剂量1、免疫剂量2、免疫剂量3、免疫剂量4五个处理组，共15组，每个剂量组6只幼兔，颈部皮下注射兔瘟疫苗。注射疫苗后，每周1次耳静脉或心脏采血。血液置37℃温箱内1小时，10000rpm/min离心10min，吸取上清。血清置56℃水浴锅内30min后，用于测定抗体效价。
" ^4 Q% E* k8 G: _) Q* n" B1.3 兔瘟抗体效价的测定
微量血凝抑制试验（HI）方法检测兔瘟抗体[10]。取50µl待检血清用等量生理盐水进行倍比稀释6个梯度，分别在每孔加入等量的4单位血凝病毒，37℃感作30min，加入等量的1％人“O”型红细胞，4℃感作30min,观察结果。同时设阳性血清和阴性血清作为对照。结果以平均数±标准差表示，用SPSS软件从剂量和日龄两个角度作统计分析。
# M6 ^1 J, V1 y6 G5 T2 结果与分析
2.1 35日龄不同剂量组的抗体效价
" t$ \& P0 @9 D9 U& l7 e" z35日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4后，其抗体产生速度较剂量1组快，剂量2、3、4组抗体效价一直显著高于剂量1组，剂量2、3、4组抗体效价峰值5.83显著高于剂量1组峰值3.25，有效抗体维持时间(>7周)大于剂量1组的2周。35日龄组幼兔剂量2、3、4组之间抗体产生速度、峰值、维持时间均无显著差异（表1）
- F6 o$ B. M6 B& n) ^2 C; c) E1 s; O  ~表1  35日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 1. Diversification of the antibody of the 35 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫
剂量        免疫前        免疫后
- H+ ?8 |6 h! Y  W/ f  Z. c+ T                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
  I, J& q8 T1 ]0        2.50±0.41        1.25±0.95b        1.00±0.82c        0.75±0.96c        0.25±0.50d        0.25±0.50d        0.00±0.00d        0.00±0.00c
( @- m) S7 h3 H5 ]6 B1        2.50±0.41        3.25±0.50a        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00c        1.00±0.00c        0.75±0.50c        0.00±0.00c
2        2.00±1.00        4.00±0.00a        4.66±0.58a        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71b        4.50±0.73ab        4.50±0.53a
3        2.00±1.00        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00b        5.25±0.35ab        4.25±0.23b        4.00±0.34b
! V, e+ `/ z. X( ^  ]4        2.33±0.58        4.00±1.00a        4.33±0.58a        5.33±0.58a        5.83±0.29a        5.50±0.00a        4.75±0.56a        4.33±0.26ab
注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
Note: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same as follows.
5 e6 @- u2 s0 x
$ Z  U8 i$ C0 c; ^) y/ @1 ?# N2.2 40日龄不同剂量组的抗体效价
# f9 F* p0 D. K, p8 k# w# T! J5 E40日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，剂量2、3、4组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，剂量2、3、4组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表2）
表2  40日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
+ B8 N( ^; m  X' ]8 Z) V0 r4 sTable 2 .Diversification of the antibody of the 40 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫剂量        免疫前        免疫后
2 p" Q) ]' v' x: o- e7 H) u                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
% ?& b: s) V. V/ z" e" |* N; q  K0        1.25±0.58        1.00±0.82b        0.75±0.96b        0.25±0.50b        0.20±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
1        1.25±0.96        3.00±0.82a        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96b        3.00±0.82b        2.13±0.50b        1.83±0.58b
2        1.33±0.58        4.33±1.15a        5.83±0.29a        5.17±0.29a        5.33±0.58a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        4.50±0.00a
7 T: P$ A- \8 {' {7 G3        1.27±0.58        4.00±1.00a        5.50±0.50a        5.17±0.29a        5.00±1.00a        5.00±0.58a        5.00±0.29a        4.50±0.00a
  n) i3 o* ]" l2 @; m" @) ^2 \4        1.33±0.58        4.33±0.58a        5.83±0.29a        5.17±0.35a        5.33±0.58a        5.00±0.00a        5.00±0.35a        4.50±0.29a

2.3 45日龄不同剂量组的抗体效价
45日龄组幼兔兔瘟疫苗免疫剂量2、3、4组后，其抗体产生速度较剂量1组快，免疫后第2周，各剂量组抗体效价均到达峰值，且各剂量组抗体效价峰值没有显著差异。免疫后第4周，剂量1组抗体效价显著下降，免疫后第5周，2～4单位剂量剂量组抗体效价显著高于剂量1组抗体效价，2～4单位剂量剂量组有效抗体维持时间大于剂量1组有效抗体维持时间（表3）。
表3  45日龄幼兔免疫不同剂量兔瘟疫苗后抗体效价的变化
Table 3 .Diversification of the antibody of the 45 day-old rabbit immuned with different doses of vaccine
免疫剂量        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
0        1.00±0.57ab        0.80±0.96b        0.35±0.50b        0.25±0.50c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c        0.00±0.00c
3 D1 B( c! s9 Y- k* ]) X2 F! `$ m1        2.00±0.82a        3.25±1.26a        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96b        3.25±1.26b        2.38±1.79b        2.00±1.41b
2        1.00±0.00ab        4.00±1.00a        5.17±0.58a        4.83±0.29b        5.16±0.76ab        5.50±0.45a        5.50±0.00a        4.75±0.59a
+ f  X3 a' t' |/ Y# M8 k( {2 n3        1.00±1.00ab        4.47±0.50a        5.25±1.06a        5.50±0.00a        5.75±0.35a        5.25±1.06a        5.00±0.50a        4.50±0.56a
! N* Z; e3 x! Y) ?5 L( t4        0.33±0.58b        4.33±0.58a        5.50±0.00a        5.50±0.00a        5.25±0.35ab        5.25±0.35a        5.00±0.50a        4.50±0.36a

2.4 35、40、45日龄组免疫剂量1疫苗后的抗体效价
- {" P' R% j6 p4 t注射剂量1疫苗时，免疫后第1周，各日龄组之间抗体效价没有显著差异，免疫后2～3周，3个日龄组抗体效价均上升至峰值，40、45日龄组抗体效价均显著高于35日龄组，40、45日龄组之间抗体效价没有显著差异，35日龄组有效抗体维持时间为2周，40～45日龄有效抗体维持时间为4周（表4）
表4  不同日龄幼兔免疫剂量1后抗体变化比较
Table 4 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 1-unit dose of vaccine
# w6 f$ p* L) e9 t% b& Z免疫日龄        免疫前        免疫后
! A3 B- u/ `9 n5 l0 X1 O9 w                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
35日龄        2.50±0.41a        3.25±0.50        3.00±0.82b        2.38±0.48b        2.00±0.00b        1.00±0.00b        0.75±0.50b        0.00±0.00b
! g' S% I+ _7 t! C* n' a40日龄        1.25±0.96b        3.00±0.82        5.75±1.71a        5.00±1.83a        2.75±0.96 ab        3.00±0.82a        2.13±0.50a        1.83±0.58a
45日龄        2.00±0.82ab        3.25±1.26        5.25±0.96a        5.50±1.29a        3.75±0.96a        3.25±1.26a        2.38±1.79a        2.00±1.41a
注：同列数据标有不同字母者表示差异显著（P<0.05）。以下数据同。
, R2 N; O) r" F6 V8 ~. B% iNote: data with different superscripts withine a column show different significantly(p<0.05). The same ac follows.

2.5 35、40、45日龄组免疫剂量2疫苗后的抗体效价
1 `: r8 ?. B8 X; ^1 D# I$ T" J8 D注射剂量2兔出血症疫苗之后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表5）
8 W# o! w9 L; [. ^& U( N表5  不同日龄幼兔免疫剂量2后抗体变化比较
Table 5 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 2-unit dose of vaccine
* ]) k3 u3 Y* _! y) S: S/ u; Z免疫日龄        免疫前        免疫后
                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
5 D( Y# O9 @' _$ \. u+ F; c35日龄        2.00±1.00        4.00±0.00        4.66±0.58b        5.50±0.71a        5.67±0.58a        5.00±0.71        4.50±0.73b        4.50±0.53
% v" Z7 l% C8 Y" r. i; u40日龄        1.33±0.58        4.33±1.15        5.83±0.29a        5.17±0.29ab        5.33±0.58ab        5.33±0.00        5.00±0.00ab        4.50±0.00
45日龄        1.00±0.00        4.00±1.00        5.17±0.58ab        4.83±0.29b        5.16±0.76b        5.50±0.00        5.50±0.00a        4.75±0.59

2.6 35、40、45日龄组免疫剂量3、4疫苗后的抗体效价
- @0 Q# ]) t5 p8 m2 f4 f用剂量3、4注射兔出血症疫苗后，各日龄组均在免疫后1周抗体效价升至保护性效价，各日龄组抗体效价峰值之间没有显著差异，40、45日龄组抗体效价峰值到达的时间为2周，35日龄组抗体效价峰值到达的时间为4周，各组有效抗体维持时间没有显著差异（表6、7）。
: A6 m% f. M; l3 @0 L表6  不同日龄幼兔免疫剂量3后抗体变化比较
5 x  i  `) @1 L) ITable 6 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 3-unit dose of vaccine
; r, Z) @4 H3 c5 g5 l: b3 j免疫
& A9 p/ A: w! }- F. p日龄        免疫前        免疫后
/ P0 q0 z. Z/ E* u/ A- h                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
35日龄        2.00±1.00        4.00±1.00        4.33±0.58        5.33±0.58        5.00±0.00        5.25±0.35        4.25±0.23b        4.00±0.34
3 ?7 v( ^* O/ f' B. `, k# Q40日龄        0.67±0.58        4.00±1.00        5.50±0.50        5.17±0.29        5.00±1.00        5.00±0.00        5.00±0.29a        4.50±0.00
1 J# x! g: M- S% c: C. g45日龄        1.00±1.00        4.47±0.50        5.25±1.06        5.50±0.00        5.75±0.35        5.25±1.06        5.00±0.50a        4.50±0.56

5 O3 m4 M8 `! e, [表7  不同日龄幼兔免疫4单位剂量后抗体变化比较
3 x/ J+ ]/ m3 M' ?- ^7 hTable 7 The comparasion of the antibody of different days-old rabbits immuned with 4-unit dose of vaccine
免疫
4 I5 [& X( F6 m0 c3 _  v" @日龄        免疫前        免疫后
2 j( s: M2 V( h% h                1周        2周        3周        4周        5周        6周        7周
* [( D; j+ W+ {  C' |9 [/ e( O35日龄        2.33±0.58a        4.00±1.00        4.33±0.58b        5.33±0.58        5.83±0.29        5.50±0.00        4.75±0.56        4.33±0.26
40日龄        1.33±0.58ab        4.33±0.58        5.83±0.29a        5.17±0.35        5.33±0.58        5.00±0.00        5.00±0.35        4.50±0.29
45日龄        0.33±0.58b        4.33±0.58        5.50±0.29a        5.50±0.00        5.25±0.35        5.25±0.35        5.00±0.50        4.50±0.36
% G8 g. |/ g5 d/ n4 R+ N
3 小结与讨论
3.1 相同日龄免疫剂量与抗体产生之间的关系
, s: P3 j8 A# J3 h' Q* X+ g- _35日龄的剂量2、3、4组的抗体峰值、有效抗体维持时间、抗体产生速度均显著大于剂量1组，但是剂量2、3、4组之间的抗体峰值、有效抗体维持时间没有显著差异，抗体产生速度与40、45日龄的剂量2、3、4组均为1周，抗体峰值的产生较40、45日龄的剂量2、3、4组仅慢1周。40日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。45日龄的剂量1、2、3、4组之间的抗体峰值无显著差异，剂量2、3、4组的抗体产生速度、有效抗体维持时间显著高于剂量1组。
3.2 同一剂量的不同免疫日龄与抗体产生之间的关系
免疫结果表明，不同日龄在免疫剂量1时，免疫日龄与血清抗体峰值和有效保护时间呈正相关。35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值均显著小于其它日龄组。免疫剂量2～4时，35日龄的抗体上升速度、有效抗体维持时间、抗体峰值与其它日龄组之间无显著差异。说明加大剂量之后，可以解决当前存在的免疫程序问题。
0 q/ R! |5 G* ~* H& k1 d        目前，国内幼兔免疫机理方面的研究开展很少，人们对其免疫规律以及机理还不是十分清楚。本研究结果证明了兔出血症免疫程序中确实存在一些问题，同时提出了一些建议以供参考，并为进一步的深层次研究提供了实践依据。

[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-1-31 16:25 编辑 ]

张连春

:vic tory:

薛家宾

建议再看一下另一篇文章-免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响.
1 ?8 ?6 O& G2 @8 f3 k
[ 本帖最后由 薛家宾 于 2008-2-3 08:46 编辑 ]

1985su

兔瘟/波氏。魏氏苗的效果确实。大肠杆菌根本就多余，巴氏还有一定的用途

王高

从薛老师得到的提示应该是35日龄的小日龄可以注射，加倍注射效果好。但是我们实际当中的商品肉兔都是28日龄断奶，到35日龄也隔了好几天了。我想问实际当中刚刚断奶时可否注射兔瘟疫苗？请薛老师看看行不行。

qiuhuangang

谢谢教授........

王高

好