有机磷酸酯类中毒与解救

【目的和原理】 观察有机磷农药中毒的症状及血胆碱酯酶活性（chE）的抑制情况，通过比较阿托品、解磷定的解救作用，掌握两药的作用原理。 有机磷酸酯类中毒后，胆碱酯酶（chE）活性受到抑制，失去水解乙酰胆碱（Ach）的能力，Ach在体内蓄积，引起一系列中毒症状（M样、N样和中枢神经系列症状）。抗胆碱药阿托品能拮抗Ach的作用，解除有机磷酸酯类中毒的M样症状。胆碱酯酶复活药解磷定能使被有机磷酸酯类抑制的胆碱酯酶活性恢复，对M及N样症状有效。两药合用可提高解救效果。 【实验动物】 家兔，2.5-3.0kg 【实验器材和药品】 婴儿台秤、注射器（1ml、10ml）、10%敌百虫、0.1%阿托品、2.5%解磷定、0.5%肝素 【实验步骤和观察项目】 1. 实验步骤 ①取家兔两只，分别称重后观察下列项目：活动情况，呼吸情况，心率，瞳孔大小，唾液，肌张力。 ②将甲、乙两只家兔分别用0.5%肝素润洗过的1ml注射器从心脏取血0.5ml。 ③取血后静脉注射10%敌百虫1ml/kg，密切观察各项指标，并记录（一般10-15分钟出现中毒症状）。待中毒症状明显时，按上法取心脏血0.5ml，测定血内胆碱酯酶活性。然后甲兔立即静脉注射0.1%阿托品1ml/kg(1mg/kg)，乙兔静脉注射2.5%解磷定4ml/kg（100mg/kg），观察甲、乙两兔中毒症状的改变，至症状明显消失时，分别记录表内，按上法再次取心脏血0.5ml，并测定血内chE活性。 ④取血后，甲兔给与补充注射解磷定，乙兔给与注射阿托品，剂量同上。 ⑤实验后，实验动物给与相应处理。 2.观察项目： 有机磷中毒与解救过程中家兔生理指标前后变化情况 兔号 体重 药物及剂量 一般情况 呼吸情况 心率 瞳孔 大小便 肌张力 肌震颤 唾液分泌 血chE活性 甲 兔 用药前 用敌百虫后 用阿托品后 乙 兔 用药前 用敌百虫后 用解磷定后 【注意事项】 1. 心脏取血前必须用0.5%肝素润洗，以防止凝血。 2. 耳缘静脉注射敌百虫时应小心谨慎，因敌百虫刺激性强，家兔易动，故需稳妥固定。另敌百虫易腐蚀血管，故注射敌百虫后易再推注生理盐水1ml，防止血管老化。 3. 心脏取血方法：一人稳妥固定家兔，腹面向上，采血者一手持浸润过的采血用注射器，另一手指于家兔前胸部查找心跳最强处（一般位于胸骨左缘4-5肋间），于肋间隙进针，垂直刺入，待有突破感即刺入胸腔，垂直向下刺入心脏。判断刺入心脏方法：刺入后，松开注射器，观察其颤动方式，如刺入心脏，则注射器颤动均匀稳定，与心跳频率一致，此时回吸血液，有血液进入则证明进入心脏。取血时采血注射器只允许垂直刺入，不得斜向或滑动，如第一次没有成功取血，应取出采血针，放开家兔，稍待片刻，再行采血。 4. 如给敌百虫10分后症状不明显，可酌情补一些。家兔出现瞳孔极度缩小或后肢震颤时应积极解救，应与注射敌百虫同时准备好相应剂量解救药物。并在实验最后给与甲兔补充解磷定，乙兔补充阿托品。 【思考题】 根据本次实验结果，分析有机磷酸酯类的中毒机制，比较阿托品和解磷定的解救效果并掌握两药的作用原理。 全血胆碱酯酶活性的比色测定法（Hestrin法） 【目的和原理】 血液胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解。在一定条件下，水解的乙酰胆碱的量和酶的活性成正比，故在反应体系中加入一定量的乙酰胆碱，经血液中的胆碱酯酶作用后，测定剩余的乙酰胆碱之量，便可得知以水解的乙酰胆碱的量，从而测出胆碱酯酶活性。 剩余乙酰胆碱量的测定，系利用乙酰胆碱与羟胺生成异羟肟酸，后者在酸性条件下又与Fe3+作用，生成红棕色的异羟肟酸铁络合物，其颜色的深浅可以反映乙酰胆碱含量的多少，反应过程如下： 1. 盐酸羟胺与氢氧化钠作用释放出游离羟胺 NH2OH·HCL+NaOH→NH2OH+NaCL+H2O 2．剩余乙酰胆碱与游离羟胺作用，生成羟肟酸化合物。 （CH3）3≡N-(CH2)2OCOCH3+NaOH→CH3CONHOH+（CH3）3≡N-（CH2）2OH 3．异羟肟酸化合物在酸性环境中与三氯化铁生成褐色的复合物（异羟肟酸铁络合物） FeCL3+CH3CONHOH→[CH3CONHO]3Fe （红棕色） 【实验器材和药品】 10只洁净试管，试管架，移液管，恒温水浴，721分光光度计 药品： 1. 磷酸盐缓冲溶液（PH=7.2）：取Na2HPO41.67g和KH2PO40.272g，加蒸馏水溶解，稀释至100ml。 2. 乙酰胆碱溶液：取氯化乙酰胆碱0.127g，加蒸馏水10ml（冷藏备用），临用前稀释至100ml，成0.007M浓度。 3. 3.5M NaOH：取NaOH14g，用蒸馏水配制成100ml。 4. 碱性羟胺：用等体积的1M羟胺溶液和3.5M NaOH溶液于临用前20分钟内混合而成。 5. 盐酸溶液：取比重1.18的浓盐酸50ml，加蒸馏水100ml。 6. FeCl3试剂（0.37M FeCL3）：取10g FeCl3·6H2O，用0.1NH4CL配制成100ml（若用无水FeCl3,则取6.009g） 【实验步骤和观察项目】 1． 实验步骤： ① 取10只洁净试管，编号，按下表次序加入各种试剂，每加一种试剂后充分摇匀。 ② 甲兔（阿托品）/乙兔（解磷定） 试剂 空白管 标准管 用药前 用敌百虫后 用阿托品/解磷定后 磷酸盐缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 全血 0.1（第一次心脏取血） 0.1（第一次心脏取血） 0.1（第一次心脏取血） 0.1（第二次心脏取血） 0.1（第三次心脏取血） 37°C水浴预热3min 0.007M 乙酰胆碱 / / 1.0 1.0 1.0 37°C水浴保温20min 碱性羟胺溶液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 0.007M 乙酰胆碱 / 1.0 / / / 室温静置2min 4N盐酸溶液 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 10%三氯化铁 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 0.007M 乙酰胆碱 1.0 / / / / 滤纸过滤后上清液置于后5只洁净试管，于15min内用光电比色计比色（波长525nm） （单位：ml） 2． 观察项目： 比色时空白管校正光密度到0，读取标准管和测定管之光密度，记录各样品光密度值，代入公式，求胆碱酯酶活性。 计算： 标准管光密度—测定管光密度×70=全血chE活性单位数 标准管光密度 【注意事项】 1． 每次滴加液体后，应迅速震荡混匀。 2． 每1ml血液在规定条件下分解1μm的乙酰胆碱定为一个chE活力单位。 3． 0.007M乙酰胆碱溶液中含有乙酰胆碱7μm，每管中加入血样0.1ml， 7×1/0.1=70。