丝状真菌纤维素酶的结构与功能
纤维素是植物光合作用的主要产物，是地球上最丰富的可再生性能源物质。微生物对它的降解是自然界碳素循环的主要环节。对这个过程的有效利用则可望为农业、畜牧业、发酵工业以及化学工业等持续提供廉价的原料。同时在环境污染的防治、良性生态系统的建立上也会发挥重要作用。纤维素可被内、外切纤维素酶（葡聚糖酶）协同催化水解为可溶性糖类，但作为植物结构性材料，由β-1,4-糖苷键联结葡萄糖残基构成的纤维素，具有很难被微生物降解的特性，与由 α-1,4-糖苷键联结葡萄糖残基组成的淀粉相比，它的分子转换率要较淀粉酶低约二个数量级。但由β-1,4-糖苷键构成的纤维寡糖却较由 α－1,4-糖苷键构成的糊精更易被水解 ；纤维素无定形区的酶解速率也与淀粉相近，这都表明影响纤维素酶解速率的限制性因素不是糖苷键的构型，而应是纤维素结晶区的超分子结构。 本论文正是针对这一在理论上仍然未能阐明，而又是进入实用时，必需解决的关键难题而开展研究的。涉及的主要的科学问题为：既然内、外切纤维素酶都遵循同一机制催化纤维素分子链内β-1,4-糖苷键的水解，为什么纤维素结晶区的有效降解必需有这二类纤维素酶的协同作用？ 二类酶底物专一性不同的原因在那里？主要在纤维素酶分子结构域水平上开展了研究。
论文取得的创新性结果，有以下 5点：
1提出了色氨酸荧光的变化能够作为酶构象变化的探针来揭示酶高级结构的变化。这种构象特性对研究酶的底物专一性具有重要的意义。（刊：J.Protein.Chem, 1997 ,16:681-688。中国生物化学与分子生物学报 1998，14：181-185）
在纯化得到2个外切纤维素酶和2个内切酶纤维素的纯组分和酶的生物学，物理化学性质研究的基础上（刊：生物化学杂志1997,13:362-364，生物化学杂志 1997，13:580-585），进行了2类酶的内源荧光，圆二色谱（刊：生物化学杂志 1997，13:580-585）氨基酸残基化学修饰 （刊：生物化学杂志, 1997,13:302-307）及酶解过程动力学的比较研究（刊：纤维素科学与技术，1997, 5: 16-21）探索色氨酸在内，外切酶结构与功能关系中的作用。结果表明它的确位于酶的活性位点，而且与底物结合有关。荧光光谱测定指出酶的荧光几乎都来自色氨酸残基，酶分子中色氨酸微环境对pH变化非常敏感，降低pH导致了酶分子构象发生了较大变化，配基结合使酶分子色氨酸微环境产生了改变，引发了与pH诱导不同的构象变化。NBS氧化表明，当NBS: 酶大于60后，被修饰的色氨酸为4.2个，当配基CMC和纤维二糖加入后，再用NBS氧化，酶活力与相应对照比较可分别保存92.1%和87.5%。纤维二糖的结合可使NBS修饰的色氨酸数由4.2个降至3.1。这表明约有一个色氨酸残基被保护了。圆二色谱测定表明：当酶活力趋于完全丧失时，NBS氧化也未使酶的构象发生明显的变化，所以，被修饰的色氨酸中很可能有一个位于或接近酶的活性位点。动力学测定表明：修饰引起了酶的Km值增大，Kcat却没有明显变化，这暗示着酶的底物结合功能发生了改变，因此，色氨酸很可能位于或接近酶的底物结合位点。荧光激发和发射峰值测定结果表明：酶分子的荧光主要来自色氨酸残基的贡献。配基结合可能色氨酸微环境发生了变化，纤维二糖的结合很可能使色氨酸从羧基或咪唑基的附近离开了，而导致荧光不再表现大的pH依赖性。pH诱导的配基结合是敏感的，降低pH可能导致了一些色氨酸更加暴露；配基结合改变了色氨酸的微环境，同时使酶分子构象发生了变化，从而酶的整体构象不随pH变化，因此，色氨酸荧光的变化能够作为酶构象变化的探针来揭示酶的高级结构的变化，研究结果为首次报道。
2, 首次证明内、外切纤维素酶催化结构域三维结构的细微差别是其底物专一性不同的原因，提出了一个解释内、外切酶与底物作用时，底物专一性不同的运动模式（刊J.Protein Chem，1997,16:59-66，J.Protein Chem 1998, 17:107-111）
以低浓度的十二烷基磺酸钠（SDS）为微扰剂处理外切酶CBHI表明低浓度的SDS处理可显著增加CBHI的内切酶活力。由荧光、圆二和二阶导数谱测定表明，其内切酶活力增加的原因可能为CBHI活性部位附近色氨酸所处微环境变化所致。还进一步观察到N-溴代琥珀酸钠修饰内切酶EGI时,酶活力的完全丧失先于酶的荧光强度淬灭发生，增加纤维二糖浓度可增加对酶荧光淬灭发生的保护（刊：J. Protein Chem 1998, 17:107-111，J.Protein.Chem, 1997 ,16:681-688）,都表明催化结构域中的色氨酸位于底物结合位处。用荧光和园二色谱研究拟康氏木霉CBHI和EGI，在不同pH和配基结合时的构象变化，无配基时，二者构象变化相似，加入配基时导致了不同的变化，在低pH区，EGI构象变化的pH依赖性较CBHI大，EGI较CBHI更易受外源干扰。这都表明EGI活性部位的结合色氨酸较CBHI更加暴露于溶剂中。根据上述试验结果，我们提出了一个解释内、外切葡聚糖酶与底物作用时底物专一性不同的运动模式: CBHI活性部位呈桶状，只能允许纤维素分子链的末端进入和进行末端水解出纤维二糖（图2A）；EGI活性部位为一开放的裂隙，可使酶分子“骑”在纤维素分子链上，进行随机性内切，水解出纤维寡糖（图1.B）
3．发现内、外切纤维素酶分子的结合结构域除与不溶性纤维素结合之外, 还具有非水解性破坏纤维素结构、降低结晶度，形成短纤维的能力。首次为结晶纤维素的有效降解必需有内、外切纤维素酶二者的协同作用机理，提供了试验证据。（刊：J.Protein Chem 。1997,16:59-6，纤维素科学与技术,1998,6:1-9.）
经木瓜蛋白酶有限酶切EG I，CBH I分别都得到了一个对可溶性底物具有与天然酶相近活力的催化结构域和含两个的能吸附纤维素的吸附结构域(F-III; P-III)。外切纤维素酶的N-端是封闭的,全酶分子的含糖量为12%, 而催化域仅为1.5%；远紫外CD测定表明:CBHI分子缺乏220nm的“trough”,a- 螺旋含量也很小;具195nm的正峰和205~215nm 的负峰,表明了它是一个富含b-结构的蛋白。当降低pH(6--3.2), CBHI 和其催化结构域(CBHI-core)的构象只发生了微小改变；而当纤维二糖加入后,CBHI 和CBHI-core的构象不再随pH 变化而变化, 两者的光谱性质也非常相似, 这表明CBHI的光谱性质主要由其催化域决定。天然EGI的C-端氨基酸是Leu-Ser-Pro，而EG-core的C-末端也为 Leu-Ser-Pro,这表明EGI的催化域(EGI -Core)很可能是位于整个酶分子的C-端．圆二色谱测定结果表明 EGI和它的催化域具有相似的结构特征：富含b结构，较少a螺旋结构．同时表明了由有限酶切产生的是一个具有独立构象的结构域．
F-III或P-III分别处理棉纤维，短时间即可见有短纤维的产生。但并未检测到有还原糖的产生。且这个过程并无时间依赖性, 增加F-III或P-III浓度，短纤维的产量增加。短纤维的β-1,4-糖苷键更易于被内、外切纤维素酶进一步水解为还原糖。这表明F-III，P-III中都包含有非水解性破坏纤维素结构的功能域。半个世纪前提出了纤维素的降解需要一个非水解性因子的假说，但尚未能找到这个组分。 非水解性破坏纤维素结构、形成短纤维的能力的功能区的发现，推动了纤维素酶分子结构域研究工作的深入开展。
4.提出甘氨酸可为酶类活性部位提供柔性，可用“G-X-Y”短肽模式预测糖苷酶类活性部位的方法. （G指甘氨酸，刊：J Biol. Chem,1997,265:3190-3194）
在对纤维素酶分子结构与功能研究的基础上，为了对其进行蛋白质工程设计提供新的线索，我们对已知其三维结构的23个酶（分属于6大类酶）的活性位点区域的氨基酸基出现规律，做了统计分析。发现它们都是富含G-X-Y残基的，而且一般以G-X-Y（或Y-X-G）寡肽出现。并具有X，Y残基的极性相反，它们的分子量和极性也较小，G-X-Y寡肽出现的频率远较其它区域高等特点。酶的其他区域则无此特征性寡肽，表明甘氨酸可为酶类活性部位提供柔性，这是酶活性位点构象变化所必需的。以纤维素酶和过氧化物酶为例，对做此了寡肽来构建酶的活性位点是切实可行的。
构象分析。是预测酶活性位点研究的一个成功的偿试，表明用G-X-Y
5．提出了糖蛋白发生N-糖基化时对序列模式的要求和糖基化的作用
是防止蛋白酶水解(酶切)的新观点
（刊：纤维素科学与术,1998,6:1-9,J.Protein.Chem, 1999,
18:511-521）
分析了纤维素酶被蛋白酶有限酶切的结果，酶切位点都位于“Linker”（链接区）附近，发生在一些由Gly，Ser和Thr组成的寡肽上，而这样的肽已被证明是蛋白酶切位点：G-S-T，A-G/G-A，G-G-Y这里Y时常是疏水基团。另一特征是几个Linker的糖基化程度和糖链也不同。我们的结果和已报道的结果都表明糖基化不是纤维素酶活力所必需，什么是糖基化的作用呢？仔细考察不难发现：外切酶的Linker是糖基化的，内切酶的Linker不是糖基化的，外切酶的Linker中含有一些可能的蛋白酶切位点，而内切酶中却几乎没有。所以，糖基化的作用应该是防止蛋白酶切。这种功能作用对纤维素酶的功能可能是很重要的。
论文得到的上述创新性的研究成果,在纤维素酶分子结构与功能研究中尽管还都是阶段性的，但它在纤维素结晶区难被降解和必需内，外切纤维协同作用等关键难题的解决上都有了实质性的前进。它对后续研究已发挥了启发推动价用，如纤维素结合结构域非水解性破坏纤维素结构现象的发现，已成为本实验室继续深入研究的主要课题（刊：微生物学报1998，38：269-275，中国学术期刊快报，1998，4：974-975，Macromolecules 2000，在审）。
G-X-Y预测活性中心的研究成果引起了广泛的兴趣，（SCI检索,1998-1999内被他引10次，自引3次）. 纤维素酶糖基化作用是防止蛋白酶水解(酶切)的新观点已被试验证实（刊载：中国生物化学与分子生物学报，1999，15：885-887）
